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Bloco 1: Físico Química
Aluna: Stefane Adriene Arruda Lima

Determinação de lipídeos pelos métodos de Soxhlet e Bligh-Dyer

1. INTRODUÇÃO

Os lipídios, também chamados de gorduras são compostos orgânicos altamente energéticos, contêm ácidos graxos essenciais ao organismo e atuam como transportadores das vitaminas lipossolúveis. Os lipídios são substâncias insolúveis em água, solúveis em solventes orgânicos, tais como éter, clorofórmio e acetona, clorofórmio, benzeno e álcoois. (ADOLFO LUTZ)

Estes solventes apolares extraem a fração neutra que incluem ácido graxos livre, mono, di e triacilglicerois, e alguns mais polares como fosfolopidios e glicolipidios

A determinação de lipídios em alimentos é feita, na maioria dos casos, pela extração com solventes, por exemplo, éter. Quase sempre se torna mais simples fazer uma extração contínua em aparelho do tipo Soxhlet, seguida da remoção por evaporação ou destilação do solvente empregado. O resíduo obtido não é constituído unicamente porlipídios, mas por todos os compostos que, nas condições da determinação, possam ser extraídos pelo solvente. Estes conjuntos incluem os ácidos graxos livres, ésteres de ácidos graxos, as lecitinas, as ceras, os carotenoides, a clorofila e outros pigmentos, além dos esteróis, fosfatídios, vitaminam A e D, óleos essenciais etc, mas em quantidades relativamente pequenas, que não chegam a representar uma diferença significativa na determinação. Nos produtos em que estas concentrações se tornam maiores, a determinação terá a denominação mais adequada de extrato etéreo. Uma extração completa se torna difícil em produtos contendo alta proporção de açúcares, de proteínas e umidade. (ADOLFO LUTZ)

(Método de Bligh-Dyer). (ADOLFO LUTZ)

No caso de alimentos, nem sempre é possível extrair diretamente a gordura. Se a amostra for úmida é necessário proceder a uma secagem, pois a água impede a penetração total do solvente. Quando os lipídeos se encontram ligados a proteínas ou açúcares, faz-se necessário uma hidrólise prévia, como no método de Gerber. Em alguns casos, em vez de combinação de hidrólise e extração, é suficiente tratar a amostra com uma mistura de clorofórmio e metanol

Para amostras que podem ser extraídas diretamente, são usados equipamentos que realizam a extração por solvente como o aparelho de Soxhlet (extração intermitente). O extrato obtido diretamente sem tratamento prévio pode conter, além da gordura, quantidades pequenas de ceras, resinas, esteróis e carotenoides.

Os métodos utilizados nesta pratica foram à extração com solvente a frio (método de Bligh-

Dyer) e extração a quente (método de Soxhlet). A amostra utilizada foi um biscoito de chocolate.

1.1 OBJETIVOS

Essa pratica teve como objetivo determinar o conteúdo de lipídios totais da amostra de biscoito pelos métodos de Bligh-Dyer e de Soxhlet.

2. REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 LIPÍDIOS

São moléculas que podem funcionar como combustível alternativo à glicose, pois são os compostos bioquímicos mais calóricos para geração de energia metabólica através da oxidação de ácidos graxos. Resultam da combinação de ácidos graxos com álcoois, são, portanto, ésteres.

É um conjunto de substâncias, que não são caracterizadas por grupo funcional comum e sim pela sua alta solubilidade em solventes orgânicos e baixa solubilidade em água. Fazem parte de um grupo conhecido como biomoléculas. Os lipídeos se encontram distribuídos em todos os tecidos, principalmente nas membranas celulares e nas células de gordura.

A maioria dos lipídeos é derivada ou possui na sua estrutura de ácidos graxos. Algumas substâncias classificadas entre os lipídeos possuem intensa atividade biológica; elas incluem algumas das vitaminas e hormônios.

Ao contrário das demais biomoléculas, os lipídeos não são polímeros, isto é, não são repetições de uma unidade básica. Embora possam apresentar uma estrutura química relativamente simples, as funções dos lipídeos são complexas e diversas, atuando em muitas etapas cruciais do metabolismo e na definição das estruturas celulares.

Os lipídios podem ser classificados como saponificáveis, ou seja, a partir da reação de hidrólise alcalina com condições de temperatura, formam sabões, que são sais de ácidos graxos. Já os insaponificáveis não possuem ácidos graxos na sua cadeia, ou seja, não formam sabões por hidrólise alcalina.

Os lipídeos simples são formados por Carbono, Hidrogênio e oxigênio. Eles se dividem em dois grupos: Triglicérides ou glicerídeos são formados quando o álcool é o glicerol; Ceras ou

Cerídeo são formados quando o álcool tem um peso eminente. Lipídeos Complexos além do Carbono, Hidrogênio e Oxigênio, nos lipídeos complexos também há nitrogênio, fósforo entre outros.

Existem dois tipos de lipídeos complexos: Fosfolipídeos que completam as membranas celulares. É proveniente de fosfórico do glicerol e Esfingomielina é encontrada nos animais, e responsável por produzir a bainha de mielina, que rodeia o axônio dos neurônios.

Os esteroides são lipídeos formados pelo colesterol. Agem no organismo como hormônios, e também tem uma função estrutural, por isso é um componente essencial para os organismos. Portanto, as glândulas sexuais, como a testosterona, o estradiol são esteroides.

Os lipídios formam juntamente com os carboidratos e as proteínas, o grupo de compostos mais importante em alimentos e mais frequentemente encontrado na natureza, tanto em vegetais como em animais. As principais fontes de energia utilizadas pelo homem se encontram entre os lipídios: as gorduras fornecem em peso 2,3 vezes mais calorias que os carboidratos e proteínas, e apesar desses dois últimos grupos de compostos se transformarem em gorduras no organismo humano, alguns lipídios têm funções biológicas específicas. A grande maioria dos lipídios apresenta um grande número de ligações C-H e possui poucos heteroátomos. Esta característica faz com que estas moléculas sejam pobres em dipolos localizados.

As funções dos lipídios são complexas e diversas, participando em etapas cruciais do metabolismo e na definição das estruturas celulares, entre estas funções estão: Armazenamento e transporte de combustível metabólica sendo uma reserva de energia em animais e sementes oleaginosas. A reserva sob a forma de gordura é muito favorável pois não contribuem para a pressão osmótica dentro da célula, e, por não possuírem água em sua estrutura, esta também não interfere no rendimento calórico por grama de lipídeo; Componente estrutural das membranas biológicas; Películas protetoras, estas biomoléculas oferecem isolamento térmico, elétrico e mecânico para proteção de células, órgãos e para o organismo como um todo; Dão origem a moléculas mensageiras, como hormônios ( ex:. Prostaglandinas) etc.

São vários os usos dos lipídios: Alimentação, como óleos de cozinha, margarina, manteiga, maionese; Produtos manufaturados: sabões, resinas, cosméticos, lubrificantes.

Os lipídios contribuem essencialmente para as características sensoriais dos alimentos, como textura, aroma, cor e sabor atribuindo palatibilidade aos produtos. Por sua lenta digestão, os lipídios conferem a sensação de plenitude gástrica, espaçando, por conseguinte, as refeições.

Os lipídios são popularmente conhecidos como Óleos e gorduras. A distinção entre Óleos e gorduras consiste basicamente no estado físico em que se encontram sob temperatura ambiente - 35ºC. Gorduras são solidas (35ºC) óleos são líquidos (35ºC)

As fontes de lipídios, especificamente ácidos graxos saturados, mais comumente encontrados são as gorduras animais, encontradas na carne bovina, de carneiro, de porco e de galinha; estão presentes também na gema do ovo e nos derivados do leite integral; e em certos óleos vegetais, como o óleo de coco e de folhas de palmeiras, a margarina hidrogenada e as manteigas vegetais.

O excesso de lipídios que o ser humano ingere, causa obesidade, colesterol elevado, complicações cardiovasculares, doenças degenerativas (como a esclerose múltipla).

Já a falta de lipídios no organismo pode causar a dermatite (eczema), uma sensação de frio acentuada, a diminuição na produção de alguns hormônios, o comprometimento no revestimento da célula nervosa (bainhas de mielina) e a diminuição na produção de vitaminas lipossolúveis.

A recomendação que se tem hoje é de um consumo de 15%-30% do valor total da dieta. Isso é o que corresponde a mais ou menos 60g de lipídios nas quantidades máximas e 30g nas quantidades mínimas. Todavia, esse valor pode ser totalmente alterado de acordo com as necessidades individuais do indivíduo. Essa quantidade deve vir em maior parte de lipídios insaturados, podendo ser monoinsaturados, poliinsaturados etc. Normalmente estes lipídios estão presentes nos óleos vegetais em geral, nas oleaginosas, em alguns peixes (como a sardinha e o salmão) entre outros.

2.1.1 IMPORTANÇIA DA ANALISE

Rotulagem; Padrões de identidade do alimento; Pesquisa: efeitos das gorduras e dos óleos sobre as propriedades funcionais e nutricionais dos alimentos; Etapa prévia para caracterização de lipídios porcromatografia à gás.

2.2 MÉTODOS DE QUANTIFICAÇÃO

O método mais comumente empregado é o gravimétrico após a extração por meio de solventes orgânicos.

Em produtos como pão e leite, a gordura está ligada a proteína e carboidratos e, portanto, deve ser liberada para quantificação. Esta liberação é feita por hidrólise ácida ou alcalina.

2.2.1 Processo de Gerber (Hidrólise ácida)

Utilizado somente para leite e produtos lácteos, a gordura presente no leite está em forma de emulsão de óleo e água, cercada de um filme de proteína, este filme é rompido através do tratamento com ácido sulfúrico.

2.2.2 Processo de Babcock(Hidrólise ácida)

Processo semelhante ao de Gerber, diferenciando nas quantidades de leite e ácido sulfúricos adicionados, e na adição de água quente em vez álcool isoamílico. Ambos os métodos não determinam os fosfolipídios, mas não há problemas com o leite integral que tem apenas 1% de fosfolipídios na gordura total O método de Gerber é 2 a 3 vezes mais rápido que o de Babcock.

2.2.3 Método de Rose-Gottlieb e Mojonnier (Hidrólise Alcalina)

A amostra é tratada com hidróxido de amônia e álcool para hidrolisar a ligação proteínagordura, e a gordura separada é então extraída com éter de petróleo e éter etílico. O álcool precipita a proteína que é dissolvida na amônia e a gordura separada pode ser extraída com éter. A extração com éter é muito eficiente em amostras com muito açúcar como, por exemplo, leite condensado.

Extração mais eficaz quando amostra é seca antes da análise à maior penetração do solvente,

Pode usar-se amostra que foi utilizada para determinar humidade; Preparação cuidadosa da amostra a evitar degradação.

2.2.4 MÉTODO SOXHLET

O extrator Soxhlet,é um aparelho de laboratório feito de vidro, inventado em 1879 por Franz

Von Soxhlet. Ele foi originalmente desenvolvido para a extração de lipídeos (biomoléculas compostas por carbono (C), hidrogênio (H) e oxigênio (O), fisicamente caracterizadas por serem insolúveis em água, e solúveis em solventes orgânicos, como o álcool, entre outros) a partir de um material sólido e quaisquer outros compostos difíceis de extrair a partir de material sólido.

Este equipamento utiliza refluxo de solvente em um processo intermitente (éter de petróleo). A amostra não fica em contato com o solvente muito quente, porém ocorre um gasto excessivo de solvente, pois o volume total deve ser suficiente para atingir o sifão (dispositivo utilizado para transportar um líquido de uma altura para outra mais baixa, passando por um ponto mais alto).

O extrator de Soxhlet é a melhor forma de extração continua utilizando um solvente quente. Isso por que, utiliza uma quantidade relativamente pequena de solvente e apresenta bons resultados. Consiste basicamente de um reservatório de vidro que fica entre um balão na parte inferior e um condensador no topo. Dentro do reservatório é colocado o material sólido envolto em papel de filtro na forma de um pequeno cartucho. No balão fica o solvente escolhido e no condensador há fluxo de água. O balão é aquecido com uma manta elétrica de modo que o solvente entre em ebulição. O vapor condensa e goteja sobre o cartucho, solubilizando a substancia a ser extraída. O aparelho de Soxhlet possui um sifão que permite o refluxo continuo do solvente. Quando o reservatório enche e atinge a altura do sifão, este transborda levando o solvente e o extrato para o balão.

A eficiência do método depende: Natureza do material a ser extraído; Natureza e polaridade do solvente; Ligação dos lipídeos com outros componentes; Circulação do solvente através da amostra; Tamanho das partículas; Umidade da amostra; Velocidade de refluxo; Quantidade relativa de solvente.

2.2.4.1 Características

O extrator utiliza o refluxo do solvente; Só pode ser usado com amostras sólidas; A amostra não fica em contato direto com o solvente em ebulição; A quantidade de solvente deve ser suficiente para atingir o sifão.

2.2.5 MÉTODO GOLDFISH

O método de Goldfish também é um método utilizado em amostras secas em um sistema de refluxo contínuo de solvente a quente num equipamento capaz de realizar a extração em mais de uma amostra. Possui a vantagem de utilizar uma menor quantidade de solvente que o método de Soxhlet alem de ser mais rápido que o método que Soxhlet, pois pelo método ser continuo faz com que a amostra esteja em contato permanente com o solvente, esse contato direto pode ser uma desvantagem, pois pode ocorrer degradação devido ao contato com o solvente a quente.

2.2.6 MÉTODO DE BLIGH-DYER

Em 1959, sugeriram um método para extrair gordura a frio que utiliza uma mistura de três solventes: Clorofórmio, Metanol e Água. Através da mistura dos três solventes em diferentes proporções são formadas duas fases distintas uma de clorofórmio onde tem se os lipídeos e outra de metanol e água contendo os compostos não lipídicos. A fase de clorofórmio é então separada num balão para a gordura ser quantificada (Cecchi, 2003).

Também pode ser usado em escala micro, isto é, a analise é feita em tubos de ensaio com a vantagem de proporcionar uma maior precisão na analise e reduzir gastos pelo gasto menor de solvente.

2.2.6.1 Características

A extração é a frio para amostras que serão avaliadas quanto ao nível de peroxidação e perfil de ácidos graxos; Pode ser usado para qualquer tipo de amostra (seca ou úmida).

2.2.7 CARACTERÍSTICAS FÍSICAS E QUÍMICAS DO BISCOITO GERAL

(ANVISA) Acidez em solução normal, máximo, 2,0 ml/100g. Umidade, máximo, 14,0% p/p. Resíduo mineral fixo: máximo 3,0% p/p (deduzido e sal). Sobre a composição físico química da amostra (biscoito) analisada não tivemos acesso a tabela nutricional. Também não encontramos na legislação a quantidade de lipídios especifica na legislação para cada grama do biscoito.

A Sociedade Brasileira de Alimentação e Nutrição (SBAN 1990) recomenda que as calorias ingeridas diariamente estejam assim dividas: Proteínas 10-12%Lipídios 20 25%

3. METODOLOGIA 3.1 Material

Método de Bligh-dyer

Amostra (biscoito) Metanol

Clorofórmio

Solução aquosa de sulfato de sódio 1,5%

Pinças

Espátulas

Béquer de 100 ml

Béquer de 50 ml, previamente aquecido (a 110°C) e tarado.

Pipeta volumétrica de 5 ml

Pipeta de 25 ml

Funil de vidro pequeno

Papel de filtro

Pipetadores

Placa de agitação

Balança analítica

Papel alumínio

3.2 Procedimentos a. Pesamos entre 3,0 e 3,50g da amostra triturada b. Transferimos a amostra pesada para o béquer de 100 ml c. Adicionamos exatamente

I. 10 ml de clorofórmio I. 20 ml de metanol I. 8 ml de água destilada d. Tampamos com papel alumínio e colocamos os béqueres num agitador por 30 minutos e. Em seguida foi adicionado exatamente i. 10 ml de clorofórmio i. 10 ml da solução de sulfato de sódio 1,5% i. Tampamos e agitamos por mais 2 minutos. iv. Deixamos separar as camadas de forma natural f. Descartamos a camada superior com auxilio de uma pipeta g. Filtramos rapidamente num funil pequeno com papel de filtro h. Foi medido exatamente (pipeta volumétrica) 5 ml do filtrado e despejado em béquer de 50 ml previamente seco e pesado .

% lipídios totais = p x 4 x 100	p= peso dos lipídios (g) contido em 5 mL
g	g = peso da amostra (g)

i. Colocamos o béquer numa estufa a 80°C até evaporar o solvente (15-20 minutos). Foi resfriado em dessecador e pesado em balança analítica. 116,7505g j. Cálculos;

3.3 MATERIAL Método soxhlet

Extrator de soxhlet com refluxo Balão de fundo chato

Cartucho de celulose ou de papel

Solvente

Estufa

Dessecador

Balança analítica

3.4 Procedimentos

3. Pesamos aproximadamente 5g de amostra no cartucho e colocamos no extrator e

1. Lavamos os balões e colocamos na estufa a 105°C por uma hora 2. Em seguida colocamos os balões no dessecador e após seu resfriamento pesamos acoplamos no balão; 4. Colocamos o solvente e o conjunto na placa aquecedora:

5. Ligamos a água de circulação;

6. Deixamos por 6 horas e recuperamos o solvente 7. Retiramos os balões da placa e colocamos na estufa por uma hora: 8. Retiramos os balões da estufa e colocamos no dessecador por aproximadamente 30 minutos e pesamos. 9. Cálculos % Gordura = (Peso do balão + gordura) – peso do balão/ peso da amostra x 100

4. RESULTADOS

% lipídios totais = 116, 8548 x 4 / 3.1457 x 100

4.1 Método de Bligh-dyer

4.2. Método soxhlet % Gordura = (104, 0423) – 103.2754 /5,0058 x 100

4.3 TABELAS - % de lipídios Método % lipídios totais no biscoito

Bligh-dyer	14858, 98%
Soxhlet	15,32%

Através dos dados apresentados na Tabela 1 é possível verificar que o método de Soxhlet apresentou menor erro na analise em relação ao método de Bligh-Dyer. O fator que pode ter atrapalhado no Bligh-Dyer é a amostra não estar devidamente triturada e homogeneizada que acaba atrapalhando a penetração do solvente na amostra dificultando assim a extração da gordura além do método exigir muitas operações que acaba por aumentar o erro da analise.

Como já foi dito não encontramos dados na legislação, especificando o teor de lipídios para cada grama de biscoito, nem na literatura.

5. CONCLUSÕES

O método de Soxhlet apresentou o melhor resultado, provando a eficiência do método para produtos com baixo teor de umidade como o biscoito, que não apresentou bons resultados com Bligh-Dyer que pode ser chamado de método coringa, pois serve tanto para amostras úmidas quanto secas.

Os resultados encontrados em Bligh-Dyer ficaram muito distantes do valor real da gordura do alimento, o que prova que esse método é melhor para fazer extrações e não quantificações podendo ser caracterizado como um método qualitativo tendo que ser aplicado para amostras com alta concentração de água.

Para Bligh-Dyer apresentar uma melhor precisão o recomendado seria utilizar o método micro, que além de reduzir o custo da analise, reduz a probabilidade de erro.

O objetivo foi alcançado.

5.1 VANTAGENS E DESVANTAGENS DO MÉTODO DE SOXHLET 5.1.1 vantagens

Evita contato longo da amostra com solvente muito quente. Não há decomposição da gordura

5.1.2 Desvantagens

Possível saturação do solvente dificulta a extração

5.2 VANTAGENS E DESVANTAGENS DO MÉTODO DE BLIGH-DYER 5.2.1 vantagens

Extrai todos os lipídios (incl.polares) Extração sem aquecimento

Extratos podem ser usados para determinar índices de peróxidos e ácidos gordos livres, carotenoides, vit. E, composição de ácidos gordos e esteróis.

Utiliza-se com produtos secos e úmidos

Determinação não requer equipamento sofisticado

Pode ser realizada em tubo de ensaio

5.2.2 Desvantagens

O método apresenta uma grande probabilidade de erros devido a grande quantidade de manipulação na amostra

Tanto no método de Soxhlet quanto no Bligh-Dyer a gordura é quantificada através de métodos gravimétricos, onde se realiza a evaporação do solvente com o lipídeo num balão, finaliza a remoção do solvente por aquecimento em estufa e pela diferença do peso do balão vazio e do balão com a gordura obtêm-se a quantidade de gordura extraída.

6. REFERENÇIAS

CECCHI, Heloisa Mascia. Fundamentos teóricos e práticos em analise de alimentos. 2 ed.- campinas, SP; editora unicampi, 2003.

INTITUTO ADOLFO LUTTZ. Métodos físico-químicos para análise de alimentos. 1 Ed digital. Versão eletrônica./coordenadores Odair Zenebon, Neus Sadocco Pascuet e Paulo Tiglea -- São Paulo: IMESP, 2008. Cap IV, pg 117.

CARLOS EDUARDO. Lipídios em Alimentos. Disponível em:< <http://w.td.utfpr.edu.br/carlos/Apostila%20Lip%EDdios.pdf>> acessado em 12 de outubro de 2012

MONIIQUEQUIMA. Lipídios. Disponível em:< <http://w.ebah.com.br/content/ABAAABO-wAA/lipidios>> acesso em 12 de outubro de 2012

DEIVES ROCHA. Fontes de Lipídios. 9 de julho de 2008. Disponível em:<< http://educacaofsicaparavida.blogspot.com.br/2008/07/fontes-lipdicas.html>> acessado em 12 de outubro de 2012

GILMAR NEVES. Soxhlet. Disponível em:<< http://www.ebah.com.br/content/ABAAAAQYAK/soxhlet>> acessado em 12 de outubro de 2012

THOMAS ONG. Determinação de lipídios em alimentos. 2011 Disponívelem:<http://w.fcf.usp.br/Ensino/Graduacao/Disciplinas/Exclusivo/Inserir/Anexo s/LinkAnexos/LIPIDIOS%202011.pdf> > acessado em 12 de outubro de 2012

ANVISA. Legislação, Resolução - CNNPA nº 12, de 1978. Disponível em:<< http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/12_78_biscoitos.htm>> acessado em 12 de outubro de 2012

CLAUDIO GUILLIANO. Proteínas, Lipídios e Carboidratos. Unicamp. Disponível em: << http://www.nutriweb.org.br/n0202/recomend.htm>> acessado em 12 de outubro de 2012

ANA GABRIELA. Extração em extrator de soxhlet. Manaus – AM. 2011. Disponível em:<<http://w.ebah.com.br/content/ABAAAelB0AC/relatorio-extracao-extrator-soxhlet> > acessado em 13 de outubro de 2012

VANESSA WENDT. Determinação de Lipídios pelo método de Soxhlet. Disponível em:<<http://w.ebah.com.br/content/ABAAABHoEAE/4-relatorio-bioquimicadeterminacao-lipidios-pelo-metodo-soxhlet>> acessado em 13 de outubro de 2012